多瘤病毒（BK） 核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針?lè )ǎ┓磻鞒坛Ｒ幊绦?/h1>

瀏覽次數：1209發(fā)布日期：2020-10-28

多瘤病毒（BK） 核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針?lè )ǎ?/strong>反應流程常規程序

將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(gè)循環(huán)。重復這樣的循環(huán)25～35次，使擴增的DNA段大量累積。后，在72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。

2．復性（退火）和延伸溫度

復性的溫度是PCR擴增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。

3．反應時(shí)間

變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時(shí)間可適當延長(cháng)。復性時(shí)間有30秒種一般是足夠的。延伸時(shí)間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來(lái)保證充足的時(shí)間。

4．循環(huán)次數

循環(huán)次數主要與模板的起始數量有關(guān)，在模板拷貝數為104～105數量級時(shí)，循環(huán)數通常為25～35次。

平臺效應（plateaueffect）：PCR擴增過(guò)程后期會(huì )出現的產(chǎn)物的積累按減弱的指數速率增長(cháng)的現象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì )出現末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現非特異性競爭作用，擴增產(chǎn)物自身復性，高濃度擴增產(chǎn)物變性不*。

5．PCR反應液的配制

PCR反應體系的配置方式有時(shí)也會(huì )影響反應的正常進(jìn)行。常規方法與其它酶學(xué)反應一樣，在后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒(méi)有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。

對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時(shí)，有時(shí)會(huì )擴增不出產(chǎn)物。在遇到這個(gè)問(wèn)題時(shí)，如果將反應成分分開(kāi)配制，A管含模板、引物和dNTP，以及調整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來(lái)，可較好地克服這個(gè)問(wèn)題。

按照常規的方法配制反應體系，有時(shí)會(huì )出現非特異性擴增的問(wèn)題。熱啟動(dòng)（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問(wèn)題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當PCR反應進(jìn)入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應成分才會(huì )混合在一起。

上一篇：猴補體蛋白5C5酶聯(lián)檢測試劑盒液體類(lèi)標本收集
下一篇：痢疾桿菌（SH）核酸檢測試劑盒組成及試劑配制