PCR擴增試劑盒可在標準的37℃-42℃的溫度范圍內操作。過(guò)高的溫度會(huì )對反應體系產(chǎn)生不利的影響,因為酶會(huì )逐漸地失去全部活性。對于RT試劑盒,我們建議客戶(hù)在40℃下運行反應,因為逆轉錄酶在稍高溫度下具有更高的活性。

　　PCR擴增試劑盒是指在PCR擴增反應體系中加入熒光基團，通過(guò)對擴增反應中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測,通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

　　以探針?lè )晒舛縋CR為例：PCR擴增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團。開(kāi)始時(shí)，探針完整地結合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時(shí)，Taq酶將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。

　　傳統的PCR進(jìn)行檢測時(shí)，擴增反應后需要進(jìn)行染色處理及電泳分離，并且只能作定性分析，不能準確定量，易造成污染出現假陽(yáng)性，使其應用受到限制。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現了對模板的定量，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動(dòng)化程度高和無(wú)污染的特點(diǎn)，使得熒光定量PCR逐漸取代常規PCR。

　　在PCR擴增反應的數個(gè)循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線(xiàn)，這樣的直線(xiàn)即是基線(xiàn)，這條線(xiàn)是可以自動(dòng)生成也可以手動(dòng)設置的。之后反應會(huì )進(jìn)入指數增長(cháng)期，這個(gè)期間擴增曲線(xiàn)具有高度重復性，在該期間，可設定一條熒光閾值線(xiàn)，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般會(huì )將熒光閾值的缺省設置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10 倍。每個(gè)反應管內的熒光信號到達設定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數被稱(chēng)為CT值，這個(gè)值與起始濃度的對數成線(xiàn)性關(guān)系，且該值具有重現性。