熒光素酶檢測試劑盒是生物體內催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，可以從細菌、螢火蟲(chóng)、海星等生物中提取出來(lái)。熒光素酶的這種催化底物產(chǎn)生自發(fā)熒光的特性可以靈敏地檢測基因的表達。

 

　　可分別催化各自的底物發(fā)出不同顏色的熒光，且兩種光吸收波長(cháng)不同，檢測互不干擾，因此可在同一個(gè)化學(xué)反應體系中同時(shí)使用，作為雙熒光素酶報告基因系統使用，已成為研究轉錄因子參與基因調控的有效手段,通過(guò)對啟動(dòng)子DNA片段的分析,驗證啟動(dòng)子結合元件的反式激活能力,探討轉錄因子在信號轉導中的分子機制。

 

　　熒光素酶檢測試劑盒實(shí)驗步驟：

　?。?）用生物信息學(xué)方法分析并預測啟動(dòng)子區可能的轉錄因子結合位點(diǎn)（若目標是檢測miRNA及其靶基因的靶向作用，則需要預測兩者結合位點(diǎn)）。

　?。?）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（如pGL3-basic）中。

　?。?）篩選陽(yáng)性克隆，測序。擴增克隆并提純質(zhì)粒備用。

　?。?）擴增轉錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時(shí)準備相應的空載質(zhì)粒對照，提純備用。

　?。?）培養293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長(cháng)10-24小時(shí)。

　?。?）將報告基因質(zhì)粒與轉錄因子表達質(zhì)粒共轉染細胞。

　?。?）質(zhì)粒共轉染48h后，棄去培養基，用100μl1XPBS洗1遍。

　?。?）傾斜96孔板，吸干剩余的PBS。

　?。?）去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB，使用前放到常溫。

　?。?0）每孔加50μl稀釋好的1XPLB，搖床常溫條件下?lián)u15min，進(jìn)行裂解。

　?。?1）白色不透光的96孔酶標板中每孔加步驟（10）的上清液10μl，加入100μl預先混好的LARII，2s后測數據。

　?。?2）每孔添加100μl預先混好的Stop&GloReagent，靜止2s后，測數據。