七星庫道蟲(chóng)探針?lè )晒舛縋CR檢測試劑盒使用方法

七星庫道蟲(chóng)探針?lè )晒舛縋CR檢測試劑盒使用方法：

一、樣品DNA的制備

用自選方法提取細菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。產(chǎn)品僅用于科研

二、制備O157:H7標準曲線(xiàn)（以10-10E6這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽(yáng)性對照，只提供沒(méi)有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽(yáng)性對照。

1. 標記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2和1號。

2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）。

3. 先將本試劑盒提供的陽(yáng)性對照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標準品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。

4. 在6號管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽(yáng)性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對照。

5. 換槍頭，從6號管中取5 μL溶液到5號管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對照。

6. 換槍頭，從5號管中取5 μL溶液到4號管中，重復上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對照。

7. NC管中不加任何陽(yáng)性對照。

8. 從1-6號管中分別取5 μL和待測樣品一起進(jìn)行定量PCR（見(jiàn)下步），每個(gè)樣品做3次重復。PCR后得到每個(gè)陽(yáng)性對照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對數值為橫軸，繪制標準曲線(xiàn)。