菌落PCR試劑盒常遇到的疑難解答：

　　Q：樣品沒(méi)有擴增產(chǎn)物而陽(yáng)性對照有產(chǎn)物出現。

　　A：可能是樣品DNA溶液中含有的細胞裂解物抑制了PCR擴增。建議將樣品DNA溶液用水稀釋5-100倍后再擴增（兩個(gè)梯度）。

　　Q：樣品和陽(yáng)性對照都沒(méi)有擴增產(chǎn)物出現。

　　A：重新設計PCR反應參數或引物。

　　Q：陽(yáng)性對照有大小不同的兩條擴增產(chǎn)物出現。

　　A：如果用戶(hù)自備的引物一條識別載體，一條識別插入片段，模板又是連接反應液，則出現此情況屬于正常，因為兩種插入方向的DNA在連接反應液里面都存在。

　　Q：菌落PCR試劑盒陰性對照有擴增產(chǎn)物出現。

　　A：如果是引物二聚體，實(shí)驗結果有效。如果片段跟陽(yáng)性對照一樣，可能有污染，其他陽(yáng)性結果也可能是污染引起，建議找到污染原因后再繼續實(shí)驗。

　　Q：一個(gè)普通菌落中一般有多少殘留的未轉化的DNA？

　　A：如果使用100ng的插入片段進(jìn)行連接反應，用1/10的連接反應液進(jìn)行轉化，再用1/10的轉化菌液涂盤(pán)，有一半插入片段進(jìn)入細菌計算，則有0.5ng的插入DNA片段游離在細胞外，分布培養皿表面。一個(gè)培養皿的表面積一般為55cm2，一個(gè)直徑為5mm的菌落（面積約0.2mm2）則平均可能含有3pg左右的游離狀的插入DNA片段，如果使用插入片段專(zhuān)一性的PCR引物，則足夠在PCR反應中產(chǎn)生假陽(yáng)性。